Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi

L’Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è una tecnica che consente la localizzazione di una specifica sequenza di DNA su preparati fissati di cromosomi, nuclei interfasici e sezioni di tessuto, ottenuti da qualsiasi tipo di materiale biologico (sangue, biopsie, liquido amniotico, gameti), sia esso fresco, crioconservato o paraffinato.
La FISH rappresenta un indispensabile complemento della citogenetica tradizionale in quanto è caratterizzata da un maggiore potere di risoluzione: ciò vuol dire che tale tecnica consente di caratterizzare anomalie cromosomiche di numero e di struttura non definibili attraverso le tecniche di citogenetica classica e di identificare riarrangiamenti criptici, non visibili neppure dopo bandeggio ad alta risoluzione.

La FISH non viene quindi applicata di routine all’analisi del cariotipo, ma solo nei casi selezionati in base a specifici sospetti diagnostici o per approfondire determinate anomalie citogenetiche.

La FISH si basa sulla proprietà del DNA di fondersi in modo reversibile e prevede il legame tra una sonda molecolare ( frammento di DNA specifico per la regione di interesse marcato con composti fluorescenti) e la sequenza di DNA complementare del preparato che è stato fissato e montato su un vetrino portaoggetti: la regione cromosomica di interesse risulta così facilmente individuabile a un microscopio a fluorescenza.

• Alfoidi: specifiche per le regioni centromeriche
• Painting: specifiche per un intero cromosoma
• Subcromosomiche: specifiche per un intero braccio cromosomico o per regioni più o meno estese di esso
• Locus-specifiche: specifiche per regioni cromosomiche di piccole dimensioni.

• diagnosi delle sindromi da microdelezione o da microduplicazione
• caratterizzazione di marker cromosomici
• caratterizzazione di riarrangiamneti cromosomici, sia bilanciati che sbilanciati
• studio delle delezioni subtelomeriche
• determinazione della percentuale di mosaicismi cromosomici
• valutazione di anomalie numeriche su amniociti non coltivati ( FISH interfasica prenatale)
• valutazione della frequenza di anomalie cromosomiche nei gameti

• Sindrome del Cri du chat
• Sindrome di Di George e Velocardiofaciali
• Sindrome di Miller Dieker
• Sindrome Smith-Magenis
• Sindrome di Rubistein Taybi
• Sindrome di Williams
• Sindrome di Wolf-Hirschhorn
• Ritardo Mentale non sindromico

La CGH-Array (aCGH) è una tecnologia in grado di evidenziare delezioni e/o amplificazioni analizzando l’intero genoma in un unico esperimento di ibridazione. Per tale motivo rappresenta l’approccio di elezione nella diagnosi di laboratorio di malattie dovute a sbilanci cromosomici criptici (di dimensione anche molto inferiore al limite di risoluzione della citogenetica convenzionale).

La tecnica si basa sull’ibridazione competitiva tra due DNA genomici (test e controllo) differenzialmente marcati e coibridati su un array di oligonucleotidi. Il potere di risoluzione della tecnica può variare a seconda della piattaforma utilizzata.

Attualmente per scopi diagnostici vengono impiegati array con risoluzione media tra 100 e 150 kb. La metodica consente di evidenziare aneuploidie, delezioni e duplicazioni ma non è in grado di evidenziare riarrangiamenti cromosomici bilanciati, mutazioni puntiformi, bassi mosaicismi o sbilanciamenti relativi a regioni cromosomiche non rappresentate sulla piattaforma.